冰冻切片免疫荧光单标实验方法-上海郑核
一、实验器材及试剂
1、实验器材
名称 厂家 型号
冰冻切片机 Thermo Cryotome E
载玻片 江苏世泰实验器材有限公司 80312-3181
载玻片 Servicebio
微波炉 格兰仕微波炉电器有限公司 P70D20TL-P4
脱色摇床 Servicebio TSY-B
涡旋混合器 Servicebio MX-F
掌上离心机 Servicebio D1008E
移液枪 Dragon KE0003087/KA0056573
组化笔 Gene tech GT1001
冰箱 青岛海尔股份有限公司 BCD-192TGN
正置荧光显微镜 日本尼康 Nikon Eclipse C1
成像系统 日本尼康 Nikon DS-U3
2、主要实验试剂
试剂 厂家 货号 稀释比
OCT包埋剂 Sakura 4583
EDTA（PH8.0)抗原修复液 Servicebio G1206
EDTA(PH9.0)抗原修复液 Servicebio G1203
柠檬酸（PH6.0）抗原修复液 Servicebio G1202
BSA Servicebio G5001
4%多聚甲醛 Servicebio G1101
PBS缓冲液 Servicebio G0002
荧光一抗：
荧光二抗：
DAPI Servicebio G1012
抗荧光淬灭封片剂 Servicebio G1401
二、冰冻切片免疫荧光实验步骤
1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分,多聚甲醛固定10min，待多聚甲醛完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA 抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复强度根据组织来确定）
3、画圈血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），甩干PBS，滴加BSA，封闭30min。
4、加一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
5、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
6、DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
7、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
8、镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光）
三、冰冻切片免疫荧光实验结果判读
DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光
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